Proizvodnja i biokemijska karakterizacija lakaze NRC 620 iz bukovača i procjena njezine učinkovitosti u bistrenju soka od jabuke.

Nakon 25 dana statičke inkubacije na 28°C, lakaza iz *Pleurotus ostreatus* NRC620 pokazala je najveću aktivnost u mediju za uzgoj gljivica. Optimalne vrijednosti pH i temperature za ovaj enzim bile su 3,0 odnosno 70°C. Nakon 2 sata inkubacije na 40°C i 50°C, aktivnost enzima zadržala je 68,33% odnosno 59,61%. Nakon 2 sata inkubacije u citrat-fosfatnom puferu (pH 7,0), aktivnost enzima ostala je na 100%. Dodatak 10 mM MgSO₄ i CuSO₄ povećao je aktivnost enzima za približno 21% odnosno 35%, dok su NaCl, MnCl₂, KCl i CaCl₂ inhibirali aktivnost enzima. Korištenjem ABTS-a kao supstrata, kinetički parametri (Km i Vmax) lakaze *Pleurotus ostreatus* NRC 620 bili su 1,99 mM odnosno 16.217 μmol min−1 L−1. Enzimska obrada uzoraka soka od jabuke značajno je smanjila i pH i viskoznost, a to smanjenje koreliralo je s povećanjem vremena skladištenja. Obrada lakazom rezultirala je blagim smanjenjem ukupnog sadržaja fenola u soku od jabuke, ali nije uočeno smanjenje antioksidativne aktivnosti.
Posljednjih godina istraživači su se usredotočili na primjenu zelene biotehnologije u prehrambenoj industriji. Lakaza je jedan od najkorisnijih enzima u prehrambenoj industriji, a nalazi primjenu u područjima kao što su prerada sokova, pečenje, stabilizacija vina i poboljšanje organoleptičkih svojstava prehrambenih proizvoda.¹Mnoge više biljke i mikroorganizmi izlučuju lakazu,²i gljive poput deuteromiceta, askomiceta i bazidiomiceta također mogu proizvoditi lakazu.³Lakaza (EC 1.10.3.2) je plava oksidaza koja reducira molekularni kisik u vodu koristeći sustav koji se sastoji od tri različita atoma bakra, čime oksidira različite fenolne spojeve i aromatske amine. Tijekom proizvodnje voćnih i povrtnih sokova, enzimsko i neenzimsko smeđenje su kritična pitanja.⁴Budući da te tvari negativno utječu na boju, okus i aromu soka, moraju se ukloniti.⁵
Od sveg voća, jabuke se najviše konzumiraju u svijetu i u Europskoj uniji. U 2019. godini proizvodnja jabuka bila je treća u svijetu, premašivši 87 milijuna tona.⁶Jabuke sadrže brojne fenolne spojeve, uključujući flavonoide i fenolne kiseline poput kofeinske kiseline i klorogene kiseline.⁷Budući da se sok od jabuke obično konzumira u svom bistrom obliku, tijekom procesa filtracije gubi se otprilike 50% do 90% fenolnih komponenti.⁸Danas potrošači obično biraju minimalno prerađene proizvode, poput mutnog soka od jabuke s visokim udjelom polifenola. Međutim, zbog visokog udjela fenola, ova vrsta soka od jabuke posebno je osjetljiva na promjenu boje i tamnjenje.⁹Razne tehnologije, uključujući metode toplinske obrade poput pasterizacije na 60–90 °C, koriste se za smanjenje ili sprječavanje tamnjenja soka od jabuka.¹⁰Međutim, prema istraživanju Sauceda-Gálveza¹¹, termička obrada može uništiti hlapljive kemikalije i utjecati na organoleptička svojstva soka od jabuke. Alternative metodama termičke obrade uključuju superkritični ugljikov dioksid, ultraljubičasto zračenje, ultrazvuk, visoki hidrostatski tlak ili homogenizaciju pod visokim tlakom.¹²Učinkovitost ovih tehnologija i prinos prikladnih voćnih sokova ovise o korištenim parametrima i karakteristikama proizvoda. Njihova široka upotreba ograničena je visokim troškovima, štetnim učincima na kvalitetu nekih prehrambenih proizvoda ili neadekvatnom inaktivacijom enzima.^13,14
Lakaza se može koristiti za stabilizaciju i bistrenje voćnog soka.¹⁵Gökmen i sur.¹⁶Preporučuje se upotreba lakaze za bistrenje voćnog soka jer učinkovito uklanja fenolne spojeve pretvarajući ih u polimere ili oligomere koji se lako uklanjaju bilo kojom ultrafiltracijskom membranom, omogućujući soku od jabuke da održi stabilnu boju i bistrinu do šest tjedana na 50°C. Pročišćena lakaza *Trichoderma* imobilizirana je na kuglicama aluminijevog oksida i korištena za selektivno uklanjanje spojeva neugodnog okusa uzrokovanih mikrobnom kontaminacijom soka od jabuke.¹⁷
Otprilike 80-90% hlapljivih komponenti jabučnog soka su esteri i aldehidi, koji soku daju jedinstvenu aromu.¹⁸Lakaza iz *Trametes versicolor* imobilizirana je na jeftinu podlogu izrađenu od prirodnih vlakana mladih kokosovih ljuski za bistrenje soka od jabuke.¹⁹Prethodne studije istraživale su stabilizaciju jabučnog soka (boja i mutnoća) korištenjem metoda bez enzima ili imobilizacije, ili u kombinaciji s ultrafiltracijom.^5,19Međutim, utjecaj gljivičnih lakaza na fizikalno-kemijska svojstva soka od jabuke tijekom skladištenja ostaje nejasan. Stoga je cilj ove studije bio eksperimentalno istražiti promjene u fizikalno-kemijskim svojstvima, sadržaju fenolnih spojeva i antioksidativnoj aktivnosti soka od jabuke nakon tretmana gljivičnim lakazama i dvotjednog skladištenja u hladnjaku. Lakaze imaju sposobnost oksidacije fenolnih spojeva, što ih čini obećavajućim za upotrebu u raznim industrijskim procesima, uključujući bistrenje soka. Ova studija ispitala je lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620, fokusirajući se na idealne uvjete za njihovu aktivnost i učinkovitost u bistrenju soka. Iako su istraživanja bukovača (P. ostreatus NRC 620) još uvijek ograničena, prethodne studije ispitivale su enzime iz različitih gljivičnih izvora, kao što su Trametes versicolor i Ganoderma lucidum. Cilj ove studije bio je procijeniti potencijalnu primjenu ovog enzima u prehrambenoj industriji i istaknuti njegova jedinstvena svojstva, posebno njegov idealan pH i temperaturu.
2,2′-Azooksibis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS) je kupljen od tvrtke Sigma-Aldrich (Kanada). Svi ostali reagensi su bili analitičke čistoće.
Centar za prikupljanje mikrobnih kultura Nacionalnog istraživačkog centra nabavio je poznati soj bukovača NRC620. Nakon subkultivacije, ovaj soj je pohranjen na kosim pločama krumpirovog dekstroznog agara na 4°C. Metoda pripreme inokuluma bila je sljedeća: 10 dana star, potpuno razvijen micelij inokuliran je na ploče krumpirovog dekstroznog agara i inkubiran na 28°C. Nakon 10 dana, tri micelijska bloka promjera 12 mm uklonjena su iz agara pomoću sterilnog metalnog bušila i stavljena u Erlenmeyerove tikvice od 250 mL s pamučnim čepovima koje su sadržavale 50 mL steriliziranog medija za kulturu (pH 5,0, kako su prethodno opisali Othman i sur.²⁰). Kulture su inkubirane na 28°C tijekom 18 dana. Kulture su zatim filtrirane kroz Whatman br. 1 filter papir, a dobiveni supernatant služio je kao izvor enzima.
Aktivnost lakaze određena je korištenjem ABTS-a kao supstrata. Reakcijska smjesa (2 mL) sadržavala je 500 μL 0,3 mM ABTS-a (otopljenog u 0,1 M natrijevom citratnom puferu, pH 4,5) i potrebnu količinu uzorka enzima razrijeđenog destiliranom vodom.^21,22S obzirom na to da lakaza može oksidirati ABTS na sobnoj temperaturi (28 °C ± 2), oksidacija ABTS-a određena je mjerenjem porasta apsorbancije na 420 nm (ε₄₂₀= 36.000 cm^-1 M ^-1) pomoću Agilent Carry-100 UV spektrofotometra. Jedna jedinica lakazne aktivnosti bila je potrebna za oksidaciju 1 μmol ABTS-a u minuti. Koncentracija proteina određena je Bradfordovom metodom korištenjem goveđeg serumskog albumina kao unutarnje kontrole.^23,24
Nakon dobivanja enzima iz soja bukovače NRC 620, njegova aktivnost je mjerena u različitim intervalima uzgoja tijekom 25 dana u statičkim uvjetima na 28 °C.
Kako bi se proučio utjecaj temperature na aktivnost lakaze, eksperimenti su provedeni u temperaturnom rasponu od 20 do 90 °C. Prije dodavanja enzima i početka reakcije, pufer (0,1 M natrijev citrat, pH 4,5) i supstrat (ABTS) su pomiješani i inkubirani 5 minuta na različitim temperaturama. Termička stabilnost enzima procijenjena je inkubacijom u 0,05 M natrijevom fosfatnom puferu (pH 7,0) na 40, 50, 60 i 70 °C tijekom 2 sata. Preostala aktivnost je zatim procijenjena pomoću ABTS supstrata.
Utjecaj pH na aktivnost lakaze procijenjen je korištenjem ABTS-a kao supstrata u 0,1 M citrat-fosfatnim puferima s rasponom pH od 2,5 do 7,0. Otopina enzima inkubirana je na 40°C dva sata u 0,1 M citratnom i Tris puferima (pH 3, 4, 6 i 7) kako bi se procijenila stabilnost pH. Preostala aktivnost s ABTS-om kao supstratom izračunata je nakon inkubacije.
Lakaza je inkubirana 10 minuta u natrijevom fosfatnom puferu (0,05 M, pH 7,0) koji sadrži različite metalne ione (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ i Mn2+) u koncentracijama od 2,5 mM odnosno 10 mM. Zatim je dodan supstrat (ABTS) za pokretanje reakcije i procijenjena je relativna aktivnost.
Oksidacija ABTS-a lakazom pri različitim koncentracijama (0,025–3 mM) mjerena je pri pH 4,5 kako bi se odredili kinetički parametri (Vmax i Km). Kinetika^konstanteMichaelis-Mentenove jednadžbe izračunate su pomoću Lineweaver-Burkovog grafa, koji prikazuje recipročnu vrijednost brzine reakcije kao funkciju koncentracije supstrata. Kinetičke konstante izračunate su iz Lineweaver-Burkovog grafa pomoću softvera GraphPad Prism verzije 6.01.
Nakon temeljitog pranja jabuka vodom iz slavine, prerezane su na pola i iscijeđene pomoću potpuno automatskog sokovnika za jabuke Braun MP80 (proizveden u Njemačkoj). Sok je filtriran kroz četiri sloja gaze. Kontrolnoj skupini nisu dodani enzimi, dok je 2,0% lakaze (najučinkovitija testirana koncentracija) dodano u svježe pripremljeni sok od jabuke, koji je zatim pohranjen na 4°C dva tjedna.
Titrabilna kiselost (TA) i pH određeni su prema metodi Boultona i dr.^al.27pH vrijednost svakog uzorka izmjerena je digitalnim pH metrom (JENWAY 3510 pH metar). Titrabilna kiselost (TA) izračunata je na temelju jabučne kiseline pomoću sljedeće formule.
Gdje su V i C volumen (mL) i koncentracija (0,1 mol/L) otopine natrijevog hidroksida korištene u titraciji. K je koeficijent pretvorbe jabučne kiseline, jednak 0,067, a W je masa (g) soka od jabuke.
Ukupne topljive tvari (^TDS) sadržaj svih uzoraka soka određen je pomoću džepnog refraktometra PAL-1 (ATAGO, Tokio, Japan). Nakon svakog mjerenja, optička leća je isprana deioniziranom vodom, a svaki uzorak soka od jabuke testiran je tri puta. Vrijednost za svaki uzorak izračunata je prosjekom tri mjerenja. Srednja vrijednost ± standardna devijacija za svaki uzorak soka od jabuke također je izračunata prosjekom tih rezultata.
Viskoelastičnost uzoraka soka od jabuke procijenjena je rotacijskim viskozimetrom (RV, Rheotest 2, Njemačka). Uzorak je smješten unutar cilindra "S2" viskozimetra. Prividna viskoznost predstavljena je nagibom krivulje naprezanja smicanja u odnosu na brzinu smicanja, koja je izračunata iz naprezanja smicanja i odgovarajućih krivulja pri različitim brzinama smicanja (od 1,00 do 437,4 s⁻¹). Formula za izračun prividne viskoznosti je sljedeća:
Gdje je η prividna viskoznost (cP), τ je napon smicanja (dyn/cm²), γ je brzina smicanja (sec⁻¹), a (τ) se izračunava pomoću vrijednosti momenta (α) i cilindra (Z) prema sljedećoj formuli: τ = Z . α.
Indeks smeđe boje određen je prema metodi Meidav ​​et al.^al.29Uzorak soka od 10 ml centrifugiran je pri 2750 x g tijekom 10 minuta. 5 ml supernatanta soka pomiješano je s 5 ml 95%-tnog etanola. Apsorbancija smjese mjerena je na 420 nm pomoću Shimadzu UV spektrofotometra (UV-1601 PC).
Ukupni sadržaj fenola (TPC) određen je kolorimetrijski pomoću Folin-Ciocalteu reagensa kako je opisano od strane Boultona i suradnika.^[27]]. Standardna krivulja galne kiseline konstruirana je za koncentracije od 0 do 500 mg/L (^r²= 0,997). Rezultati su izraženi kao ekvivalenti galne kiseline (mg GAE/mL).
Dodajte 125 μL destilirane vode i 2850 μL FRAP otopine u 25 μL soka od jabuke i ostavite smjesu u mraku³⁰min. Zatim izmjerite apsorbanciju na 593 nm pomoću Shimadzu UV spektrofotometra (UV-1601 PC). FRAP reagens je pripremljen miješanjem 300 mM acetatnog pufera (pH 3,6), 20 mM željezovog(III) klorida i 10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)triazina (TPTZ) (otopljenog u 40 mM HCl) u omjeru 10:1:1. Standardna krivulja je generirana korištenjem Troloxa kao standarda (^R²= 0,999), a rezultati su izraženi kao μM Trolox/mL.
Antioksidativna aktivnost tretiranih i netretiranih sokova određena je DPPH metodom kako bi se procijenila njihova sposobnost uklanjanja DPPH slobodnih radikala.³¹Deset mikrolitara soka pomiješano je s 1 ml otopine DPPH (100 μM) u metanolu. Nakon reakcije u mraku tijekom 30 minuta, apsorbancija smjese izmjerena je na 517 nm pomoću Shimadzu UV spektrofotometra (UV-1601 PC). Rezultati su izraženi kao ekvivalenti troloksa (μM troloksa/ml) na temelju kalibracijske krivulje (_^R2= 0,990).
Dobiveni podaci pokazali su da je maksimalna proizvodnja lakaze uočena u bukovačama NRC 620 do kraja 18. dana fermentacije, dosegnuvši aktivnost od 1302 U/L. To je poslužilo kao osnova za određivanje optimalnog vremena uzgoja za proizvodnju lakaze (Slika 1). Iako se proizvodnja enzima povećavala s povećanjem vremena uzgoja, stopa povećanja nije bila izravno proporcionalna vremenu uzgoja; nakon 21 dan, aktivnost enzima povećala se za samo 90 U/L (na 1390 U/L). Stoga je 18 dana na kraju odabrano kao optimalno vrijeme uzgoja kako bi se uravnotežio prinos proizvoda s ekonomskim koristima povećanog vremena uzgoja.
Utjecaj vremena uzgoja na prinos lakaze u Pleurotus ostreatus NRC 620. Tri (12 mm) bloka micelija gljivica inokulirana su u 50 ml sterilnog medija, a zatim uzgajana na 28 °C tijekom različitog vremena.
U skladu s drugim studijama, naši rezultati pokazuju da je idealno razdoblje kultivacije za postizanje vršne sekrecije lakaze od strane gljiva vjerojatno između 7 i 36 dana.³²Prema Ezikeu i suradnicima.³³, *Trametes polyzona* WRF03 je proizveo najveću količinu lakaze do kraja devetog dana fermentacije, sa specifičnom aktivnošću od 1637 U/mg proteina. Nadalje, Othman i sur.³⁴utvrđeno je da *Trichoderma harzianum* S7113 luči veliku količinu lakaze petog dana kulture. Brzina proizvodnje lakaze dosegla je vrhunac aktivnosti četrnaestog dana, a zatim se postupno smanjivala.³⁴Iako se lučenje enzima može dogoditi i tijekom glavne faze rasta, ono obično doseže vrhunac tijekom međufaze, a pokreće ga konzumacija izvora ugljika ili dušika.^34,35
Iako je lakaza iz Pleurotus ostreatus NRC 620 pokazala visoku aktivnost u širokom temperaturnom rasponu od 50°C do 80°C, približavajući se vršnoj aktivnosti (69–98%), njezina maksimalna aktivnost uočena je na 70°C (slika 2a). Izvan ovog temperaturnog raspona, aktivnost enzima smanjila se na približno 70°C. Ovi rezultati upućuju na to da je enzim aktivan na visokim temperaturama, vjerojatno zato što visoka temperatura povećava kinetičku energiju reakcije.
Utjecaj temperature reakcije (a) i pH (b) na aktivnost lakaze u *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperature u rasponu od 20 do 90 °C postignute su prethodnom inkubacijom smjese na različitim temperaturama tijekom 5 minuta prije dodavanja enzima i početka reakcije. Utjecaj pH na aktivnost lakaze procijenjen je korištenjem ABTS-a kao supstrata u otopinama koje sadrže 0,1 M citrat-fosfatnog pufera u rasponu pH od 2,5 do 7,0.
Prema Ezikeu i dr.^al.33Optimalna temperatura za *Trametes polyzona* WRF03 lakazu je 55 °C, što je isto kao i za *Ganodermu lucidum*.^laccase36i slično optimalnoj temperaturi (50 °C) za *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lakaza . ^Baldrian38napominje da je, kao i za druge enzimske sustave koji razgrađuju lignin, idealan temperaturni raspon za lakazu između 50 i 70 °C.
Rezultati su pokazali da je enzim pokazao najveću aktivnost pri pH 3,0, dosegnuvši 94% aktivnosti pri pH 3,5. Međutim, ostao je aktivan u širokom rasponu pH od 2,5 do 7,0 (Slika 2b). Nadalje, pokazao je veću aktivnost u kiselim uvjetima u usporedbi s neutralnim ili alkalnim uvjetima. Njegova aktivnost ostala je najmanje 77% u rasponu pH od 2,5 do 4,5, ali je dosegnula samo približno 38% pri pH 7,0. Optimalni pH za lakazu iz *Trametes polyzona* WRF03 bio je 4,533, što je isto kao pH za lakaze iz *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 i *Trametes hirsuta* 41. Međutim, prema studiji Chairina i suradnika...⁴², optimalni pH za lakazu iz *Polymorpha f. sp.* WR710-1 je 2,2, dok je optimalni pH za lakazu iz *Polymorpha f. sp.* IBL-04 5,043. Vezanje hidroksidnih aniona (inhibitor lakaze) na atome bakra T2/T3 lakaze može biti razlog smanjene aktivnosti lakaze u uvjetima neutralnog ili alkalnog pH. To može poremetiti unutarnji prijenos elektrona iz T1 centra u T2/T3 centar, čime^{ograničavajući}aktivnost enzima23,44
Inkubacijom enzima na različitim temperaturama utvrđeno je da i vrijeme inkubacije i temperatura utječu na stabilnost enzima. Značajno je da je lakaza iz *Trametes polyzona* NRC 620 pokazala veću stabilnost na 40℃ i 50℃, zadržavajući 68,33% odnosno 59,61% svoje početne aktivnosti nakon 120 minuta (slika 3a). Nasuprot tome, pod istim uvjetima (40℃ i 50℃, 120 minuta), lakaza iz *Trametes polyzona* WRF03 zadržala je 64,38% odnosno 42,92% svoje aktivnosti.³³Naprotiv, povećanje vremena inkubacije i temperature smanjilo je stabilnost lakaze *Trametes polyzona* NRC 620; Nakon inkubacije na 60 ℃ i 70 ℃ tijekom 60 minuta, njezina aktivnost smanjila se na 39,24% odnosno 1,72% (slika 3a). U skladu s eksperimentalnim rezultatima, lakaza iz *Trametes polyzona* WRF03 pokazala je veću stabilnost na 40 i 50 ℃ tijekom cijelog procesa toplinske obrade.³³Slično tome, Lueangjaroenkit i drugi^al.37i predsjedavajući i dr.^al.42izvijestili su o stabilnosti lakaza iz Trametes polyzona KURNW027 i Trametes polyzona WR710-1 na 50 °C tijekom 1 sata. Kao koristan biokatalizator primjenjiv u raznim biotehnološkim područjima, lakaza bi trebala imati dobru stabilnost i performanse u širokom temperaturnom rasponu.
Termostatska stabilnost (a) i pH stabilnost (b) lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Termostatska stabilnost procijenjena je inkubacijom otopine enzima u 0,05 M natrijevom fosfatnom puferu (pH 7,0) na 40, 50, 60 i 70 °C tijekom 2 sata. pH stabilnost procijenjena je inkubacijom otopine enzima u 0,1 M citratnom puferu i Tris puferu (pH 3, 4, 6 i 7) na 40 °C tijekom 2 sata. Preostala aktivnost izračunata je korištenjem ABTS-a kao supstrata nakon inkubacije.
Kako bismo odredili optimalne uvjete za korištenje i skladištenje enzima, istražili smo utjecaj pH na stabilnost lakaze. Izloženost različitim pH vrijednostima značajno je utjecala na stabilnost proteinske strukture, a time i na stabilnost i aktivnost molekule enzima. Rezultati su pokazali da je enzim manje stabilan u kiselim uvjetima, dok je pokazao bolju stabilnost pri višim pH vrijednostima (neutralna i alkalna područja). Pri pH vrijednostima od 7,0, 6,0, 4,0 i 3,0, stope zadržavanja enzima nakon 120 minuta bile su približno 100%, 62,54%, 52,39% i 11,14% (slika 3b). Lakaza *Strombus multisus* WRF03 pokazala je veću stabilnost pri neutralnim pH vrijednostima (5,5–6,5) i nižu stabilnost pri kiselim pH vrijednostima (ispod 4,0). Nakon 120 minuta pri pH vrijednostima od 5,5, 6,0 i 6,5, stope zadržavanja enzima bile su približno 82%, 100% i 93%.³³Khairin i sur.⁴²primijetili su da je lakaza iz Trametes polyzona WR710-1 stabilna u rasponu pH od 6,0 ​​do 7,0, dok su Sayed i sur.⁴⁵pokazalo je da je lakaza stabilnija u uvjetima neutralnog pH. Međutim, lakaza iz Cerrena unicolor također je pokazala stabilnost u alkalnim uvjetima (pH 9,0)⁴⁶Proučavane lakaze pokazale su visoku stabilnost u širokom rasponu pH vrijednosti. To bi mogla biti važna karakteristika za industrijsku primjenu.
Budući da neki metalni ioni imaju i stimulirajuće i inhibitorne učinke na aktivnost enzima, njihov utjecaj na aktivnost enzima mora se uzeti u obzir u industrijskim primjenama. To je ključno jer su metalni ioni uobičajeni onečišćujući čimbenici okoliša koji mogu utjecati na stabilnost i sintezu izvanstaničnih enzima.⁴⁷Kako bismo istražili učinke više metalnih iona na lakazu iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620, proveli smo odgovarajuće eksperimente. Kao što je prikazano na slici 4, ovisno o vrsti korištenog metala, povećanje koncentracije metalnih iona od 2,5 mM do 10 mM negativno je utjecalo na funkciju enzima. Na primjer,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺i^Cu²⁺mogao bi stimulirati i aktivirati aktivnost enzima, dok^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺i^K⁺mogao je inhibirati aktivnost enzima. Pri koncentraciji od 10 mM, Cu²⁺ i Mg²⁺ ioni bili su najpotentniji aktivatori aktivnosti lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620, pružajući stupanj aktivacije od približno 34% odnosno 20%. Međutim, pri koncentraciji od 10 mM, Ca²⁺ ioni bili su najpotentniji inhibitor lakaze, smanjujući aktivnost enzima za približno 60%.
Utjecaj metalnih iona na aktivnost lakaze Pleurotus ostreatus NRC 620. Lakaza je inkubirana 10 minuta u natrijevom fosfatnom puferu (0,05 M, pH 7,0) koji sadrži različite metalne ione u koncentracijama od 2,5 mM i 10 mM. Reakcija je zatim započeta dodatkom supstrata (ABTS), nakon čega je izmjerena relativna aktivnost.
Naši rezultati su u skladu s rezultatima drugih autora koji su otkrili da Mg²⁺ i Cu²⁺ pojačavaju aktivnost *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño i sur.⁴⁸ otkrili su da je lakaza iz *Xylaria* sp. donekle stimulirana ionima bakra (Cu²⁺). Nadalje, Foroutanfar i sur.⁴⁹ i Si i sur.⁵⁰ proveli su slična istraživanja na lakazama iz *Paraconiothyrium variabile* i *Trametes pubescens*. Mjesto vezanja bakra tipa II (T2) ovog enzima može biti zasićeno s Cu²⁺ pri određenoj koncentraciji, što može objasniti stimulaciju aktivnosti lakaze pri višim koncentracijama Cu²⁺³⁹. Budući da su lakaze gljiva bijele truleži oksidaze koje sadrže više atoma bakra, učinci iona bakra na aktivnost lakaze su raznoliki i kreću se od stimulirajućih i inhibitornih do neutralnih.⁵¹ Nasuprot tome, Zhou i sur.^[52]izvijestio je da^Cu²⁺inhibirao je aktivnost lakaze tajvanskog podzemnog termita (Odontotermes formosanus). Međutim, lakaze Cerena sp. HYB07^[53]i Clitocybe maxima^[54]nisu bili pod utjecajem bakrenih iona.
Specifičnost supstrata predstavljena je njegovim kinetičkim parametrima (Km i Vmax); što je jači afinitet vezanja supstrata za enzim, to je niža vrijednost Km i veća specifičnost supstrata.^3,21,55Kinetički parametri (Km i Vmax) lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620 određeni su pomoću GraphPad Prism 6.0 softvera crtanjem Lineweaver-Burk dijagrama (Slika 5). Pri korištenju ABTS-a kao supstrata, rezultati su bili 1,99 mM i 16217 μmol.^{min⁻¹ L⁻¹,}respektivno. Elsayed i sur.²¹izvijestili su da su vrijednosti Km za oksidaciju ABTS-a bile 0,1 mM odnosno 0,064 mM, što ukazuje na visoki afinitet izoenzima Lac A i Lac B za ABTS. Nadalje, vrijednosti Vmax bile su 0,182 μmol^min⁻¹i 0,603 μmol^min⁻¹, respektivno. Dobivena Km vrijednost bila je niža od one za Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); nadalje, njihova Vmax vrijednost (1429 mmol min⁻¹) također je bila^donjipri korištenju ABTS-a kao supstrata.33 Slično tome, Km vrijednosti ​​koncentracija lakaze Lentinus squarrosulus MR13 i Trametes sp. AH28-2 bile su 0,0714 mM odnosno 0,025 mM, a Vmax vrijednosti ​​bile su 0,0091 mM min−1 i 0,67 mM min−1 mg−1 (u odnosu na ABTS)^{, respektivno.56,57}
Istražen je utjecaj koncentracije ABTS-a na aktivnost lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620, te je prikazan Lineweaver-Burk dijagram recipročne vrijednosti početne brzine reakcije u odnosu na koncentraciju ABTS-a. Oksidacijska reakcija ABTS-a s različitim koncentracijama (0,025–3,0 mM) lakaze mjerena je pri pH 4,5 kako bi se odredili kinetički parametri (Vmax i Km). Michaelis-Mentenove kinetičke konstante izračunate su pomoću Lineweaver-Burkovog dijagrama recipročne vrijednosti brzine reakcije u odnosu na koncentraciju supstrata. Kinetičke konstante izračunate su iz Lineweaver-Burkovog dijagrama pomoću softvera GraphPad Prism 6.01.
Tradicionalni enzimi za bistrenje, poput pektinaza, hidroliziraju pektinske tvari, smanjujući viskoznost i mutnoću. Učinkovito razgrađuju strukturne polisaharide i često se koriste u kombinaciji s drugim enzimima, poput celulaza i hemicelulaza, kako bi se poboljšao prinos i bistroća. Međutim, pektinaze ne ciljaju specifično na fenolne spojeve, koji su glavni uzročnici mutnoće i oksidativnog posmeđivanja, posebno u sokovima poput soka od jabuke i grožđa.⁵⁸Nasuprot tome, lakaze kataliziraju oksidaciju fenolnih spojeva, polimerizirajući ih u veće, netopljive molekule koje se mogu ukloniti sedimentacijom ili filtracijom. Ovaj mehanizam ne samo da poboljšava bistrinu, već i produžuje rok trajanja soka smanjenjem vjerojatnosti oksidativnog posmeđivanja uzrokovanog fenolnim spojevima. Nadalje, procesi bistrenja na bazi lakaza mogu se provoditi u blagim uvjetima obrade (pH 3,5–5,5, temperatura 25–40 °C), što ih čini prikladnim za delikatne sokove bez ugrožavanja njihovih nutritivnih ili organoleptičkih svojstava.⁵⁹Studije su pokazale da tretman pektinazom može bistriti sok za 1-2 sata, dok tretman lakaze obično zahtijeva dulje vrijeme reakcije (3-6 sati) za potpunu redukciju fenolnih spojeva. Međutim, ovaj se proces može optimizirati imobilizacijom enzima ili kombiniranjem lakaze s mehaničkim metodama bistrenja.⁶⁰U ovoj studiji, enzimsko profiliranje sirovog ekstrakta otkrilo je značajnu aktivnost lakaze i α-amilaze, dok su aktivnosti pektinaze i ksilanaze bile izuzetno niske, a aktivnost celulaze nije detektirana. Stoga je smanjenje mutnoće i sadržaja fenola uglavnom posljedica djelovanja lakaze, dok bi promjena viskoznosti mogla biti djelomično posljedica djelovanja amilaze.
Tablica 1 prikazuje fizikalno-kemijske parametre svježe iscijeđenog soka od jabuke i uzoraka tretiranih lakazom. Rezultati su pokazali da je prinos svježe iscijeđenog soka od jabuke (71,59%) bio niži od prinosa uzoraka tretiranih lakazom (87,34%). Ovi rezultati su u skladu s nalazima Pilnika i Orangea.⁶¹, koji je naznačio da upotreba enzima u preradi voća može povećati prinos soka, poboljšati filtraciju i dobiti visokokvalitetan, bistar sok za koncentraciju. Povećanje prinosa soka uglavnom je posljedica povećanja sadržaja topljivih šećera u soku. Tijekom enzimske hidrolize voća, mezoglej i pektin u staničnim stijenkama proizvoda se uništavaju i pretvaraju u topljive tvari poput neutralnih šećera i kiselina.^62.pH vrijednost enzimski tretiranog soka od jabuke bila je značajno niža od one kontrolne skupine (P < 0,05), a pH vrijednost obje skupine značajno se povećala tijekom skladištenja (Tablica 1). Ovi rezultati su u skladu s rezultatima Marka i suradnika.⁶³, koji je primijetio da se pH soka od indijskih oraščića smanjio nakon skladištenja nakon toplinske obrade. Razgradnja pektina i stvaranje galakturonske kiseline nakon tretmana enzimima mogu biti odgovorni za porast pH tijekom skladištenja. pH uzoraka tretiranih enzimima ostao je između 4,05 i 4,31 tijekom skladištenja, dok se pH netretiranog soka od jabuke kretao između 4,12 i 4,33.
Ukupna kiselost (TA) i netretiranih i uzoraka tretiranih lakazom pokazala je trend smanjenja s povećanjem vremena skladištenja (Tablica 1). Smanjenje kiselosti pripisano je pretvorbi organskih kiselina u ugljikohidrate ili enzimskim reakcijama, kao i oksidaciji tijekom skladištenja soka.⁶⁴Ukupna kiselost kontrolnog soka od jabuke i uzoraka tretiranih enzimima bila je niža nego kod ostalih sokova (sok od jagode 0,9%, sok od šljive 2,2%, sok od kumkvata 1,0%, sok od marelice 2,4%, sok od naranče 0,8%), ali slična kiselosti drugih sokova (npr. sok od kruške 0,3%).⁶²Ove razlike u netretiranom svježe iscijeđenom soku od jabuke mogu biti posljedica različitih čimbenika kao što su uvjeti uzgoja, genetski čimbenici, razina zrelosti i metode obrade.⁶⁵Smanjenje ukupne kiselosti kontrolnog i lakazom tretiranog soka od jabuka u skladu je s rezultatima koje su predstavili Singh i suradnici.⁶⁶u vezi sa smanjenjem ukupne kiselosti soka od jabuke Jin Nuo nakon 74 dana skladištenja. S druge strane, Oshmiansky i Wojdylo⁶⁷nisu pronašli nikakve značajne promjene u kiselosti soka od jabuke pri proučavanju učinka tradicionalnih metoda bistrenja.
Rezultati prikazani u Tablici 1 pokazuju da je vrijednost ukupnih topljivih tvari (TSS) u soku od jabuke tretiranom lakazom bila veća od one u netretiranom uzorku. Ovi rezultati su u skladu s objavljenim studijama.⁶⁸Nadalje, Tablica 1 pokazuje da je vrijednost TSS-a kontrolne skupine soka od jabuke bila 9,58 u početnoj vremenskoj točki i dosegla 11,05 do kraja razdoblja skladištenja. Ove vrijednosti su niže od vrijednosti TSS-a svježeg soka od jabuke koje su izvijestili Hamid i suradnici.⁶⁹(11,2 odnosno 11,80). Vrijednost ukupne topljive tvari (TSS) uzoraka soka od jabuke tretiranih lakazom značajno se povećala, počevši od 11,23 i dosegnuvši 12,93 nakon dva tjedna skladištenja na 4°C (Tablica 1). Sličan porast TSS-a tijekom skladištenja uočen je i kod agruma, limuna i slatkih naranči. Povećanje ukupnih topljivih tvari (TSS) tijekom skladištenja može biti posljedica hidrolize polisaharida (škroba) u monosaharide (šećere), povećanja koncentracije zbog dehidracije soka i razgradnje pektina u soku u topljive tvari. Povećanje ukupnih topljivih tvari (TSS) vjerojatno je posljedica povećanja topljivih šećera, koji mogu nastati pretvorbom pektina ili celuloze u topljive šećere pektinom odnosno celulazom, ili hidrolizom škroba u šećere, kako su izvijestili Hamed i sur.^69.Učinak lakaze na svojstva soka od jabuke može se vizualno promatrati, jer sok od jabuke tretiran lakazom pokazuje bolju protočnost i nižu viskoznost od netretiranog soka. Ovo opažanje zabilježeno je u Tablici 1; Viskoznost uzorka tretiranog enzimom bila je 1,87 cP, dok je viskoznost kontrolnog uzorka bila 2,95 cP. Ovo značajno smanjenje viskoznosti vjerojatno je posljedica većeg kapaciteta zadržavanja vode tvari sličnih pektinu i stvaranja kohezivne mrežne strukture.
U ovoj studiji istražen je utjecaj lakaze na indeks posmeđivanja (BI) soka od jabuke mjerenjem apsorbancije na 420 nm pomoću spektrofotometra. Rezultati su prikazani u Tablici 1. Tijekom skladištenja, BI uzoraka soka od jabuke i u tretiranoj i u netretiranoj skupini pokazao je postupni trend porasta. BI odražava stupanj posmeđivanja i može poslužiti kao^važanindikator enzimskih i neenzimskih reakcija smeđenja. Apsorbancija se značajno povećala tijekom skladištenja (P < 0,05). Na kraju skladištenja,_A420Vrijednost uzoraka soka od jabuke u kontrolnoj i enzimski tretiranoj skupini povećala se za oko 217% odnosno 121% (Tablica 1). Rezultati pokazuju da enzimski tretman može učinkovito smanjiti stupanj posmeđivanja za oko 56%. Rezultati Bezerre i sur.^[19]] su u skladu s našim rezultatima; Koristili su vlakna lakaze-glutaraldehida i kokosa za bistrenje soka od jabuke, smanjujući njegovu izvornu boju za 61%.
Iako polifenoli u voćnim sokovima imaju pozitivne nutritivne i terapeutske učinke na ljudski organizam, mogu reagirati i s proteinima, uzrokujući zamućenje soka, sedimentaciju ili mutnoću, čime se mijenja okus i aroma proizvoda te smanjuje njegov rok trajanja.⁷¹Cilj ove studije bio je sigurno smanjiti sadržaj fenolnih spojeva u soku od jabuke korištenjem lakaze iz Pleurotus ostreatus NRC 620. Rezultati prikazani u Tablici 1 pokazuju da je ukupni sadržaj fenolnih spojeva u soku od jabuke tretiranom lakazom značajno smanjen prije skladištenja na 4 °C. Nadalje, ukupni sadržaj fenolnih spojeva također se smanjio tijekom skladištenja u oba proučavana uzorka (Tablica 1). Istraživanje Sandrija i suradnika.⁷²pokazalo je da sok od jabuke tretiran enzimima može zadržati svoju antioksidativnu aktivnost i sadržaj fenolnih spojeva. Međutim, rezultati studije koju su proveli Lettera i suradnici...⁷³pokazuju da tretman soka od naranče gljivičnom lakazom može smanjiti sadržaj fenolnih spojeva u njemu do 45%.
Pokazalo se da fenolni spojevi imaju svojstva poput hvatanja slobodnih radikala, redukcije i gašenja singletnog kisika, prijenosa atoma vodika i doniranja elektrona slobodnim radikalima, što ih čini snažnim antioksidansima.⁷⁴Stoga su u ovoj studiji korištene metode temeljene na DPPH i FRAP-u za procjenu učinka lakaze na antioksidativnu aktivnost soka od jabuke uskladištenog u hladnjaku 14 dana (Tablica 2). Obje metode pokazale su porast antioksidativne aktivnosti tijekom skladištenja, što može biti posljedica povećanja slobodnih fenolnih spojeva ili stvaranja produkata Maillardove reakcije (MRP), pri čemu su produkti Maillardove reakcije vjerojatno uzrok porasta antioksidativne aktivnosti.⁷⁵Neenzimske reakcije smeđenja (uključujući razgradnju askorbinske kiseline, Maillardove reakcije i kiselinom kataliziranu razgradnju šećera) proizvode smeđe pigmente (melanoidine). Međuprodukti razgradnje askorbinske kiseline i produkti razgradnje šećera (kao što su karbonilni spojevi) mogu reagirati s aminokiselinama putem Maillardovih reakcija.⁷⁶Iako je posmeđivanje voća i povrća tijekom skladištenja opsežno proučavano, naše razumijevanje tih reakcija ostaje ograničeno.⁷⁷U usporedbi s FRAP metodom, sok od jabuke tretiran lakazom pokazao je značajno nižu antioksidativnu aktivnost DPPH metodom (Tablica 2), a antioksidativna aktivnost svih uzoraka značajno se povećala s povećanjem vremena skladištenja. U ovom istraživanju korištene su dvije različite metode za određivanje antioksidativne aktivnosti jer se njihovi principi razlikuju. DPPH metoda mjeri sposobnost neutralizacije slobodnih radikala, dok FRAP metoda mjeri sposobnost redukcije iona željeza. Stoga se preporučuje korištenje više metoda za određivanje antioksidativne aktivnosti kako bi se bolje razumjela antioksidativna aktivnost proučavanih uzoraka.⁷⁸
Jedan od ključnih nalaza ove studije je da lakaza *Pleurotus ostreatus* NRC 620 pokazuje optimalnu aktivnost na 70°C i pH 3,0. U usporedbi s drugim gljivičnim lakazama koje se obično koriste za bistrenje soka, kao što su lakaze *Trametes versicolor* i *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 pokazuje veću toplinsku stabilnost i kiseliji pH. Lakaze iz *Trametes versicolor* i *Ganoderma lucidum* obično pokazuju optimalnu aktivnost u rasponu od 50-60°C i pri pH vrijednostima između 3,5 i 5,0. Ova razlika može doprinijeti poboljšanoj učinkovitosti bistrenja soka, posebno za kisele sokove gdje je stabilnost pri nižim pH vrijednostima ključna. Jedinstvena karakteristika *P. U usporedbi s drugim proučavanim gljivičnim lakazama, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 pokazuje sposobnost učinkovitog djelovanja u zahtjevnijim uvjetima. Njegova viša optimalna temperatura aktivnosti sugerira potencijalne prednosti u industrijskim primjenama, kao što su brže reakcije i smanjena mikrobna kontaminacija. Njegov nizak pH, koji je pogodan za kiselu prirodu mnogih sokova, može biti koristan u procesima bistrenja sokova. Ovi rezultati opravdavaju daljnja istraživanja za primjenu u velikim razmjerima, što *Pleurotus ostreatus* NRC 620 čini održivom alternativom tradicionalnim izvorima gljivične lakaze. U usporedbi s prethodnim studijama, otkrili smo da je optimalna temperatura 60°C, a optimalni pH 3,0. Nakon reakcije na 60°C tijekom 80 minuta, lakaza *Ganoderma lucidum* zadržala je⁴⁶% njegove aktivnosti.79 Prema Kurniawati i Nicelle⁸⁰Enzimi *Ganoderma lucidum* pokazuju izvrsnu do umjerenu stabilnost na 25°C i pH vrijednostima u rasponu od 5,0 do 8,0, te stabilnost na pH 6,0 i temperaturama u rasponu od 10 do 30°C. U ovom istraživanju otkrili smo da su optimalni pH i temperatura za aktivnost enzima za *Pleurotus ostreatus* bili 3,0 odnosno 70°C. Nakon inkubacije na 40°C i 50°C tijekom dva sata, enzim je zadržao 68,33% odnosno 59,61% svoje aktivnosti. Nadalje, lakaza Pleurotus ostreatus NRC 620 pokazala je visoku aktivnost u širokom temperaturnom rasponu od 50°C do 80°C, gotovo dosežući maksimalnu aktivnost (69%–98%), s maksimalnom aktivnošću uočenom na 70°C.
Zaključno, lakaza NRC620 iz bukovače, dobivena u statičkim uvjetima, pokazala je optimalnu aktivnost i stabilnost u rasponu pH i temperaturnih uvjeta, pokazujući superiorniju stabilnost u usporedbi s drugim izvorima enzima. Dodatak 10 mM MgSO₄ i CuSO₄ povećao je aktivnost enzima za približno 21% odnosno 35%. Kada se preradi u sok od jabuke, enzim je smanjio pH i viskoznost, dok se sadržaj fenola samo neznatno smanjio tijekom skladištenja.
Rezultati potvrđuju potencijal lakaze u prehrambenoj industriji, posebno u bistrenju pića. Specifičnom razgradnjom fenolnih spojeva, lakaza ne samo da smanjuje mutnoću i poboljšava bistrinu, već i održava kvalitetu voćnih sokova pod blagim radnim uvjetima. Za razliku od tradicionalnih sredstava za bistrenje poput želatine, bentonita i silikagela, lakaza ne stvara otpad niti uklanja ugodne arome iz pića, što je čini ekološki prihvatljivijom i održivijom opcijom. Nadalje, u usporedbi s drugim enzimima i metodama filtracije, lakaza nudi ciljano i isplativo rješenje bez ugrožavanja kvalitete proizvoda.
Kyomuhimbo, HD i Brink, HG. Primjena i strategije imobilizacije lakaza koje sadrže bakar; pregled. Heliyon 9, e13156 (2023).